赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）ELISA檢測試劑盒說明書

【概要】

赭曲霉毒素A （Ochratoxin A）是曲霉屬和青霉屬的真菌形成的次級代謝產(chǎn)物，屬烈性的腎臟毒和肝臟毒，廣泛存在于各種食物中。谷物及其副產(chǎn)品是赭曲霉毒素A的主要來源。動物實驗表明攝入了被這種毒素污染的飼料后，會發(fā)生急性或慢性中毒癥。防止污染赭曲霉毒素A的食品和飼料直接或間接地進入人類食物鏈，加強對赭曲霉毒素A的檢測十分重要。

【適用范圍】

可定性、定量檢測谷物、飼料、面粉、啤酒、紅酒、飲料等樣本中的赭曲霉毒素A。

【試驗原理】

本試劑盒采用競爭ELISA，在微孔板上預(yù)包被赭曲霉毒素A抗原，加入樣本/赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉毒素A抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的赭曲霉毒素A與預(yù)包被在微孔板上的赭曲霉毒素A抗原競爭結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉毒素A抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時被除去，再加入顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物赭曲霉毒素A抗原的含量成負相關(guān)。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物赭曲霉毒素A的含量。

【試劑盒靈敏度】

   試劑盒靈敏度：1ppb

【交叉反應(yīng)率】

   結(jié)構(gòu)類似物                                                          交叉反應(yīng)率

  赭曲霉毒素A   ……………………………………………………………  100%

  赭曲霉毒素B   ……………………………………………………………   43%

  赭曲霉毒素C   ……………………………………………………………     5%

【試劑盒組成】

1. 96孔板×1塊

2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）

0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 54ppb

3. 酶標(biāo)物 1瓶   …………………………………… 7ml

4. 顯色液1瓶   …………………………………… 12ml

5. 終止液1瓶   …………………………………… 10ml

6. 濃縮洗滌液（10×）1瓶 …………………… 50ml

7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶……………… 20ml

【需要而未提供的設(shè)備及試劑】

設(shè)備：

---微孔板酶標(biāo)儀450nm

---振蕩器

---粉碎機

---離心機

---微量天平

---微量移液器：單道 20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl

試劑：

---去離子水（或蒸餾水）

---二氯甲烷

---鹽酸

---NaHCO3

【試劑配制】

1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。

2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。

【樣品前處理步驟】

一、谷物與飼料（稀釋倍數(shù)：2.5）

1. 稱取1g粉碎的樣品，加入0.5ml 0.13M NaHCO3，震蕩1min，

2. 加入2ml樣品稀釋液，震蕩5min；

3. 室溫下，2000g離心15min；

4. 取100μl待測。

二、果汁、啤酒、飲料（稀釋倍數(shù)：1）

1. 碳酸飲料應(yīng)去除CO2（60℃水浴或振蕩去除）

2. 取2ml 樣品，加入 1ml 1mol/L HCl 振勻，加入2ml CH2Cl2 振勻 3min；

3. 室溫下，3500g離心10min；

4. 去除上層液，吸取下層1ml,加入800μl樣品稀釋液，強烈振蕩3min；

5. 室溫下，3500g離心10min；

6. 取480μl上層液，加入120μl甲醇，振蕩均勻，取100μl待測。

【檢測步驟】

一、 測定前須知：

1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。

2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。。

3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點。

4. 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

二、操作步驟：

1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。

2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。

3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。

4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

6. 小心揭開蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。

7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。

8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。

【結(jié)果判定】

1. 百分吸光率的計算

標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中赭曲霉毒素A實際量。

【注意事項】

1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2. 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3. 每種試劑使用前均需搖勻。

4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。

5. 不要使用過了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6. 儲存條件：

試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的顯色劑對光敏感，因此要避光保存。

7. 試劑變質(zhì)的跡象：

顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8. 加入顯色液后，一般顯色時間為15～30min。若顏色較淺，可延長反應(yīng)時間到35min（或更長），但不得超過40min。反之，則減短反應(yīng)時間。

9. 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【樣品最低檢測限】

   谷物、飼料  ……………………………………………  2.5ppb

   果汁、啤酒、飲料  ……………………………………   1ppb

【貯藏條件及保存期】

貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。

保存期：該產(chǎn)品有效期為12個月。